916 yıl kilise olarak ibadete açık olan yapı, Fatih Sultan Mehmed'in 1453'te İstanbul'u fethetmesiyle camiye çevrilmiştir. Fetihten hemen sonra yapı güçlendirilerek en iyi şekilde korunmuş ve Osmanlı Dönemi ilaveleri ile birlikte cami olarak varlığını sürdürmüştür. 16'ncı ve 17'nci yüzyıllarda, caminin içine mihraplar, minber, müezzin mahfilleri, vaaz kürsüsü ve maksureler eklenmiştir. Yapının dışına farklı dönemlerde yaptırılan minareler, medrese, sıbyan mektebi, muvakkithane, şadırvan, sebiller, güneş saatleri, mütevelli heyeti odası ile Ayasofya-i Kebir Camii, Osmanlı Dönemi'nde kompleks bir yapıya dönüştürülmüştür.
Ayasofya-i Kebir Camisi'nin mimarisindeki en önemli özelliği kubbesinin alışılmıştan daha büyük oluşu ve orta mekâna hâkim olmasıdır. Cami inşa edilirken, mimarlar tarafından binanın yapımında mermer, taş ve tuğla kullanılmış; kubbenin depremlerde kolay yıkılmaması için de özel olarak üretilen, hafif ve sağlam tuğlalar kullanılmıştır. Sultan Abdulmecid'in (1839-1861) emri ile 1847-1849 yılları arasında İsviçreli Fossati Kardeşler tarafından yapılan onarımlar kapsamında, dönemin en önemli hattatlarından Kazasker Mustafa İzzet Efendi tarafından ana kubbenin 11,3 metre çapındaki alanına Kuran-ı Kerim'in Nur Suresinin 35'inci ayeti yazılmıştır.
Farklı dönemlerden figürlü ve figürsüz birçok mozaik süsleme ile bezenmiştir. Yapıldığı dönemden günümüze kalan en önemli mozaik bezeme örnekleri, norteks alanında görülebilen figürsüz mozaiklerdir. Tasvir kırıcılık döneminde yapıda bulunan tüm figürlü mozaiklerin kaldırıldığı düşünülmektedir. 843 yılında bu dönemin sona ermesiyle birlikte yapıda yapılan ilk figürlü mozaik Apsis Mozaiği'dir. Galeri katı, Tympanon Duvarı, narteks, vestibül girişi, papaz odaları olmak üzere yapının birçok yerinde farklı tarihlerde yapılmış figürlü mozaikler bulunmaktadır.
1923'te cumhuriyetin ilanından sonra cami olarak kullanılmaya devam etse de, Ayasofya 1931'de kapatıldı. Ayasofya, Mustafa Kemal Atatürk'ün emri ve Bakanlar Kurulu kararı ile 1935 yılında müzeye dönüştürülmüştür. Cumhurbaşkanı Mustafa Kemal Atatürk'ün verdiği izin sonrası başlayan çalışmalar 15 yıl sürdü ve 1947'de tamamlandı.1996'da Dünya Anıtları İzleme listesine alınan Ayasofya'nın kubbesi ve minareleri, Dünya Anıtları Fonu'nun da desteğiyle 1997-2002 arasında restore edildi.Müze aynı zamanda UNESO Dünya Mirası listesinde.