Günümüz Ayasofya’sı aynı yerde fakat öncekilerinden farklı bir mimari anlayışla yapılmış olan üçüncü yapıdır. İlk yapı İmparator Konstantios (337 – 361) tarafından 360 yılında bazilikal planlı ve ahşap çatılı olarak inşa ettirilmiş, 404’de, İmparator Arkadios devrinde (365 – 408), halk ayaklanması sırasında yanarak harap olmuştur. İkinci yapı, İmparator II. Theodosios (408 – 450) tarafından 415 yılında yine aynı planla anıtsal bir girişe sahip olarak inşa ettirilmiş ve 415 - 532 yılları arasında şehrin en büyük kilisesi olmuştur. 532 yılında, İmparator Iustinianos’a (527 – 565) karşı çıkan Nika Ayaklanması’nda yanmış ve yıkılmıştır. Theodosios Dönemi yapısının anıtsal girişini süsleyen ve on iki havariyi temsil eden kuzu kabartmalı frizler, anıtsal girişe ait basamaklar ile diğer kalıntılar bugünkü zeminin 2 m. altında, İstanbul Alman Arkeoloji Enstitüsü tarafından A. M. Schneider başkanlığında 1935 yılında yapılan arkeolojik kazılarda meydana çıkarılmıştır. Kutsal Hikmet (Tanrı’nın Kutsal Sözü) anlamına gelen Ayasofya’yı, İmparator Iustinianos dünyanın en büyük kilisesi olarak, Anadolulu iki bilim adamına, fizikçi ve matematikçi Tralleisli (Aydın) Anthemios ve geometri ve mekanik ustası olan Miletoslu (Balat) mimar İsidoros’a inşa ettirmiştir. 23 Şubat 532'de yapımına başlanan kilise sadece beş yıl on ay gibi kısa bir sürede tamamlanarak 27 Aralık 537’de büyük bir törenle ibadete açılmıştır. 6. yüzyıldan günümüze kadar ulaşan mimarlık tarihi açısından, o güne kadar benzeri yapılmamış, daha sonraki dini yapılara da örnek teşkil eden dörtgen plan üzerine oturtulmuş dairesel kubbesiyle, Kubbeli Bazilika tarzında yapılmış ilk yapıdır. Bu nedenle mimarlık tarihi açısından dünyada tek olma vasfına haizdir. Kuzey Afrika, Fransa, Mısır, Suriye, Yunanistan ve Anadolu’dan getirilmiş mermerlerin yapı içinde özel bir dizaynla kullanılması, altın ve gümüş varaklı, cam ve taş mozaik taneleri ile oluşturulan iç mekan bezemeleri ile kendine özgü bir dekoratif süsleme anlayışına sahiptir. Sütun başlıklarının ince işçiliği ve üzerinde yer alan İmparator ve İmparatoriçe monogramları nedeniyle de önem arz etmektedir.
1453 yılında Fatih Sultan Mehmed’in İstanbul’u fethi ile camiye çevrilmiş ve ilk Cuma Namazı Ayasofya’da kılınmıştır. Camiye çevrilmesiyle yapıya eklenen İslami öğeler yapıya ayrı bir değer katmaktadır. Mihrabı, minberi, müezzin mahfili dönemin mermer işçiliğinin en güzel örnekleridir. Bahçesinde yer alan I. Mahmud Dönemi şadırvanı ise üzerindeki süslemeleri ile İstanbul’un en görkemli Şadırvanı olma özelliğine sahiptir.Ayasofya koleksiyonunda bulunan eserler arasında, şu an bahçe bölümünde bulunan İmparatoriçe Eudoksia heykelinin kaidesi, İmparator Theopholus Döneminde Tarsus’tan getirilmiş olan M.Ö II. yüzyıla ait bir tapınağa ait Büyük Bronz Kapı, Sultan III. Murad döneminde Bergama’dan getirtilmiş Helenistik Döneme ait yekpare mermerden yapılmış büyük mermer küpler, İslami Dönem Koleksiyonuna kayıtlı olan Padişahlar tarafından yazılmış hat levhaları ile Kazasker Mustafa İzzet Efendi tarafından yazılmış ve 7,5 metrelik çaplarıyla dünyanın en büyük hat levhaları olma özelliğine sahip, yapıldıkları dönemde yapı içinde yazılarak yerlerine asılan büyük hat levhaları, özellikleri itibariyle dünyada tek olma özelliğine sahiptirler.
Ayasofya iki Semavi dinin (Hıristiyanlık ve İslamiyet) öğelerinin bir arada, uyum içinde sergilendiği en görkemli yapılardan biri olmasının yanı sıra, Pagan tapınaklarına ait parçaları da (Efes Artemis Tapınağı somaki mermer sütunları, Baalbeck’teki Helios Tapınağı porfir sütunları, Tarsus’tan getirilmiş olan bronz kapı) içinde barındıran Ayasofya, 1985’den beri UNESCO Dünya Miras Listesi’nde yer alan ünik bir yapıdır.